材料與儀器

胎牛血清或馬血清 青霉素 卡那霉素 霍亂毒索 地塞米松 EGF 羊催乳激素或鼠催乳激素 胰島素 部分精制的前列腺調理素或精制的前列腺調理素 I型膠原蛋白酶 大鼠
生長培養(yǎng)液 鹽性培養(yǎng)液
Petri培養(yǎng)皿 手術剪 注射器和14-G插管 25ml Erlenmeyer燒瓶 金屬絲濾網(wǎng) 50ml錐形塑料離心管 尼龍濾網(wǎng) 24孔塑料培養(yǎng)板 振蕩水浴箱 離心機 血細胞計數(shù)板或Coulter計數(shù)器

步驟

1. 在無菌條件下，取出理想的前列腺葉，放入滅菌過的 60 mm Petri 培養(yǎng)皿（玻璃或塑料的，直徑為 60 mm）。
   
   2. 剪除前列腺葉的脂肪，然后稱重。
   
   3. 加入 2 ml 膠原蛋白酶（675 U/ml，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的 MSS 配制）。
   
   4. 用手術剪將前列腺葉剪成約 1 mm 大小的組織塊。組織塊應小，足夠通過 14-G 插管。
   
   5. 用注射器和 14-G 插管將組織塊移于滅菌過的 25 ml Erlenmeyer 燒瓶，然后加入膠原蛋白酶，每 0.1 g 濕組織加入 1 ml。
   
   6. 置于振蕩水浴箱，在 37°C 條件下孵育 1 h 。
   
   7. 分 3 次用 14-G 插管吸出消化的細胞懸液，然后用孔徑為 1 mm 的金屬絲濾網(wǎng)（孔徑為1 mm，與 50 ml 錐形離心管配用）將細胞懸液濾入 50 ml 圓錐形塑料離心管，以除去碎片和未消化的組織。加入等量含有 5 % 胎牛血清或馬血清的 MSS，浸洗細胞懸液。
   
   8. 在 4°C 條件下離心（100 g，5 min），收集細胞。
   
   9. 用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 混懸細胞，然后依次用孔徑為 250 μm 、150 μm、100 μm 和 40 μm 的尼龍濾網(wǎng)（與 50 ml 錐形離心管配用）過濾細胞懸液，并每次用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 沖洗濾網(wǎng)。
   
   10. 通過離心收集細胞，然后用 5 ml WAJC404 培養(yǎng)液混懸細胞。
   
   11. 計數(shù)細胞，將細胞濃度調整至 4×106 個/ml。
   
   12. 將細胞接種于 24 孔板，每孔（面積約為 2 cm2）接種 50 μl 細胞懸液（含有 2×105 個細胞）。每孔內有 1 ml WAJC404 培養(yǎng)液、10 ng/ml 霍亂毒素、1 μmol/L 地塞米松、10 ng/ml EGF、1 μg/ml 催乳激素、5 μg/ml 胰島素、10 ng/ml 前列腺調理素、100 U/m 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素。可按 McKeehan 等 [1984] 以及 Chaproniere 和 McKeehan [1986] 敘述的方法替代部分精制的前列腺調理素。
   
   13. 在 95 % 空氣和 5 % CO2 的濕潤環(huán)境和 37°C 條件下培養(yǎng)。第 3 天和第 5 天換液。第 7 天細胞可能接近單層。
   

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