一、背景介紹

克隆形成實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞存活率并探討單個(gè)細(xì)胞增殖潛能的有效方法之一。即在體外培養(yǎng)環(huán)境下，通過(guò)使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)分裂增殖至少6代，形成的細(xì)胞集群被稱(chēng)為克隆或集落。每個(gè)克隆的尺寸通常在0.3-1.0mm之間，含有50個(gè)以上的細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算克隆形成率，能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞的增殖潛力進(jìn)行量化分析。

用途：

（1）評(píng)估細(xì)胞增殖能力：克隆形成實(shí)驗(yàn)可以幫助研究人員評(píng)估細(xì)胞的增殖潛力。通過(guò)觀察和計(jì)數(shù)形成的獨(dú)立克隆，可以了解細(xì)胞在體外環(huán)境中的增殖速率和能力。

(2)研究細(xì)胞群體依賴(lài)性：克隆形成實(shí)驗(yàn)有助于了解細(xì)胞的群體依賴(lài)性，即細(xì)胞是否需要相互合作形成克隆。這對(duì)于理解細(xì)胞群體內(nèi)的相互作用和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。

(3)篩選藥物和治療方案：克隆形成實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)前后比較克隆形成率，研究人員可以評(píng)估潛在藥物或治療方案的療效。

常用的手段有兩個(gè)：

①平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，主要適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，以評(píng)估細(xì)胞的克隆形成能力。

②軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)：通過(guò)將細(xì)胞懸浮于含瓊脂糖的培養(yǎng)基中，主要用于評(píng)估貼壁和懸浮的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的克隆形成潛能。

二、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 從細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)開(kāi)始，通過(guò)胰酶消化將細(xì)胞懸浮于血清培養(yǎng)基中，并進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；

(2) 在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，控制細(xì)胞數(shù)量在400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔的范圍內(nèi)（對(duì)于不同的細(xì)胞類(lèi)型，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳細(xì)胞數(shù)量），并接種于6孔板；

(3) 持續(xù)培養(yǎng)至14天，或直到大多數(shù)單個(gè)克隆中的細(xì)胞數(shù)超過(guò)50個(gè)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔3天更換培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞狀態(tài)；

(4) 克隆形成完成后，使用1 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，固定時(shí)間為15-30分鐘。最后，用PBS洗滌；

(5) 向每個(gè)孔中加入1 mL結(jié)晶紫染液，染色時(shí)間控制在10-20分鐘內(nèi)；

(6) 利用PBS進(jìn)行多次細(xì)胞洗滌，進(jìn)行拍照（分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）。

注意：本實(shí)驗(yàn)的成功關(guān)鍵在于細(xì)胞懸液的制備和適度的接種密度，務(wù)必確保細(xì)胞均勻分散，防止細(xì)胞團(tuán)的形成，并謹(jǐn)慎確保接種密度不過(guò)于密集。

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